Extrakcia DNA & RNA

Extrakcia DNA a RNA – ako vybrať správny kit

Kvalita izolovanej DNA alebo RNA rozhoduje o výsledku PCR, qPCR, sekvenovania aj klonovania. V Aloquence nájdete kolónkové kity NucleoSpin, kity s magnetickými guličkami NucleoMag a kity NucleoBond na plazmidovú a vysokomolekulovú DNA od MACHEREY-NAGEL, kity HigherPurity™, WideUSE™ a Clean-Easy™ aj samostatné reagencie – proteinázu K, RNázu A či guanidín tiokyanát. Poradíme, ako vybrať kit podľa vzorky, formátu a následnej analýzy.

Čo nájdete v kategórii Extrakcia DNA & RNA

Kolónky, magnetické guličky alebo anión-výmenné kolóny?

Kolónky so silikátovou membránou (napr. NucleoSpin) sú najrozšírenejšie: lyzát sa naviaže na membránu, premyje a nukleová kyselina sa eluuje malým objemom pufra. Spracovávajú sa centrifugáciou alebo na vákuu a stačí na ne bežná mikrocentrifúga.

Magnetické guličky (napr. NucleoMag) nepotrebujú centrifugáciu – guličky s naviazanou DNA alebo RNA sa oddelia magnetom. Hodia sa na automatizáciu a vysoký počet vzoriek v platničkách 96 alebo 384.

Anión-výmenné kolóny (NucleoBond) sa používajú na väčšie množstvá plazmidovej DNA (midi, maxi) a na vysokomolekulovú DNA z krvi a buniek, ktorú potrebujete napríklad pre sekvenovanie dlhých fragmentov.

Ako vybrať kit: začnite od vzorky

• Typ vzorky – krv, plazma, tkanivo, bunky, rastliny, pôda, stolica, potraviny, voda, FFPE rezy alebo forenzné stopy. Špecializované kity obsahujú lyzačné pufre a kroky na odstránenie inhibítorov typických pre danú matricu.
• DNA, RNA alebo oboje – pri RNA je dôležité odstránenie genómovej DNA (napr. rDNáza v kite alebo kity „Plus“ bez štiepenia DNázou).
• Množstvo vzorky – od mikro (XS) protokolov pre malé vzorky až po midi a maxi formáty. Napríklad NucleoSpin cfDNA Midi spracuje 1–5 ml plazmy alebo séra.
• Počet vzoriek a formát – jednotlivé kolónky, 8-jamkové stripy, 96- alebo 384-jamkové platničky.
• Následná aplikácia – PCR, qPCR, RT-PCR, NGS, ddPCR, klonovanie alebo transfekcia kladú rôzne nároky na čistotu, veľkosť fragmentov a výťažok.
• Výskum alebo diagnostika – väčšina kitov je určená na výskum (RUO). Pre diagnostické laboratóriá sú k dispozícii aj kity CE-IVD, napr. NucleoSpin Dx RNA Blood.

Parametre, ktoré sledovať pri porovnaní kitov

• Elučný objem – menší objem dáva vyššiu koncentráciu (napr. 40–60 µl pri mini kitoch, 100–200 µl pri midi).
• Väzbová kapacita a typický výťažok – koľko µg nukleovej kyseliny kolónka alebo guličky zachytia.
• Čistota – pomer A260/A280 (pre DNA okolo 1,8, pre RNA okolo 2,0) a pri RNA integrita (RIN).
• Veľkosť fragmentov – pre cfDNA a FFPE sú dôležité krátke fragmenty, pre long-read sekvenovanie naopak vysokomolekulová DNA.
• Čas prípravy – napr. 6 vzoriek za ~55 min alebo platnička za ~60–90 min.
• Spôsob spracovania – centrifugácia, vákuum, magnet alebo automatizácia na robotickej stanici.
• Skladovanie a exspirácia – väčšina kitov sa skladuje pri 15–25 °C; niektoré komponenty (enzýmy) môžu vyžadovať chladenie.

Na čo si dať pozor

• Core kity obsahujú len základné komponenty (kolónky, pufre); bloky, platničky alebo skúmavky treba objednať samostatne – vždy si skontrolujte obsah balenia.
• Pri RNA pracujte s pomôckami bez RNáz, používajte filtračné špičky a vzorky udržiavajte v chlade.
• Dodržte odporúčané množstvo vzorky – preťaženie kolónky znižuje čistotu aj výťažok.
• Pri krvi a odberových skúmavkách so stabilizátorom zvoľte kit kompatibilný s daným typom skúmavky.
• Na kolónkové protokoly potrebujete mikrocentrifúgu s dostatočnou RCF, na lýzu často termoblok.

Časté otázky – Extrakcia DNA & RNA

Aký kit zvoliť na izoláciu DNA z krvi?

Pri malom počte vzoriek kolónkový mini kit, pri desiatkach a stovkách vzoriek kit s magnetickými guličkami alebo vo formáte 96 jamiek. Ak potrebujete veľmi dlhé fragmenty, zvoľte kit na vysokomolekulovú DNA, napr. NucleoBond CB.

Aký je rozdiel medzi kolónkami a magnetickými guličkami?

Kolónky sa spracúvajú centrifugáciou alebo vákuom a sú ideálne pre menší počet vzoriek. Magnetické guličky nevyžadujú centrifugáciu a jednoducho sa automatizujú, preto sú výhodné pri vysokom počte vzoriek.

Čo je core kit?

Core kit obsahuje len väzbové kolónky alebo platničky a pufre. Spotrebný materiál ako bloky, premývacie platničky či skúmavky sa objednáva zvlášť, takže sa oplatí najmä tým, ktorí ho už majú.

Môžem kity použiť na diagnostiku?

Väčšina kitov je určená len na výskumné účely (RUO). Na diagnostické použitie vyberajte kity označené CE-IVD – pri každom produkte je to uvedené v popise.

Ako zabránim degradácii RNA?

Pracujte rýchlo, na ľade a s pomôckami bez RNáz, vzorky stabilizujte čo najskôr po odbere a izolovanú RNA skladujte pri −80 °C. Pri krvi pomáhajú odberové skúmavky so stabilizačným roztokom.

Čo urobiť, keď vzorka obsahuje inhibítory PCR?

Pri pôde, stolici, rastlinách či potravinách zvoľte kit určený pre danú matricu – obsahuje kroky na odstránenie inhibítorov. Doplnkovo môžete použiť aj samostatné kolónky na odstránenie inhibítorov.