Extrakce DNA & RNA

Extrakce DNA a RNA – jak vybrat správný kit

Kvalita izolované DNA nebo RNA rozhoduje o výsledku PCR, qPCR, sekvenování i klonování. V Aloquence najdete kolonkové kity NucleoSpin, kity s magnetickými kuličkami NucleoMag a kity NucleoBond pro plazmidovou a vysokomolekulární DNA od MACHEREY-NAGEL, kity HigherPurity™, WideUSE™ a Clean-Easy™ i samostatné reagencie – proteinázu K, RNázu A či guanidin thiokyanát. Poradíme, jak vybrat kit podle vzorku, formátu a následné analýzy.

Co najdete v kategorii Extrakce DNA & RNA

Kolonky, magnetické kuličky, nebo aniontově výměnné kolony?

Kolonky se silikátovou membránou (např. NucleoSpin) jsou nejrozšířenější: lyzát se naváže na membránu, promyje a nukleová kyselina se eluuje malým objemem pufru. Zpracovávají se centrifugací nebo na vakuu a stačí na ně běžná mikrocentrifuga.

Magnetické kuličky (např. NucleoMag) nepotřebují centrifugaci – kuličky s navázanou DNA nebo RNA se oddělí magnetem. Hodí se pro automatizaci a vysoký počet vzorků v destičkách 96 nebo 384.

Aniontově výměnné kolony (NucleoBond) se používají pro větší množství plazmidové DNA (midi, maxi) a pro vysokomolekulární DNA z krve a buněk, kterou potřebujete například pro sekvenování dlouhých fragmentů.

Jak vybrat kit: začněte od vzorku

• Typ vzorku – krev, plazma, tkáň, buňky, rostliny, půda, stolice, potraviny, voda, FFPE řezy nebo forenzní stopy. Specializované kity obsahují lyzační pufry a kroky k odstranění inhibitorů typických pro danou matrici.
• DNA, RNA, nebo obojí – u RNA je důležité odstranění genomové DNA (např. rDNáza v kitu nebo kity „Plus“ bez štěpení DNázou).
• Množství vzorku – od mikro (XS) protokolů pro malé vzorky až po midi a maxi formáty. Například NucleoSpin cfDNA Midi zpracuje 1–5 ml plazmy nebo séra.
• Počet vzorků a formát – jednotlivé kolonky, 8jamkové stripy, 96- nebo 384jamkové destičky.
• Následná aplikace – PCR, qPCR, RT-PCR, NGS, ddPCR, klonování nebo transfekce kladou různé nároky na čistotu, velikost fragmentů a výtěžek.
• Výzkum, nebo diagnostika – většina kitů je určena pro výzkum (RUO). Pro diagnostické laboratoře jsou k dispozici i kity CE-IVD, např. NucleoSpin Dx RNA Blood.

Parametry, které sledovat při porovnání kitů

• Eluční objem – menší objem dává vyšší koncentraci (např. 40–60 µl u mini kitů, 100–200 µl u midi).
• Vazebná kapacita a typický výtěžek – kolik µg nukleové kyseliny kolonka nebo kuličky zachytí.
• Čistota – poměr A260/A280 (pro DNA kolem 1,8, pro RNA kolem 2,0) a u RNA integrita (RIN).
• Velikost fragmentů – pro cfDNA a FFPE jsou důležité krátké fragmenty, pro long-read sekvenování naopak vysokomolekulární DNA.
• Doba přípravy – např. 6 vzorků za ~55 min nebo destička za ~60–90 min.
• Způsob zpracování – centrifugace, vakuum, magnet nebo automatizace na robotické stanici.
• Skladování a exspirace – většina kitů se skladuje při 15–25 °C; některé komponenty (enzymy) mohou vyžadovat chlazení.

Na co si dát pozor

• Core kity obsahují jen základní komponenty (kolonky, pufry); bloky, destičky nebo zkumavky je třeba objednat samostatně – vždy si zkontrolujte obsah balení.
• U RNA pracujte s pomůckami bez RNáz, používejte filtrační špičky a vzorky udržujte v chladu.
• Dodržte doporučené množství vzorku – přetížení kolonky snižuje čistotu i výtěžek.
• U krve a odběrových zkumavek se stabilizátorem zvolte kit kompatibilní s daným typem zkumavky.
• Pro kolonkové protokoly potřebujete mikrocentrifugu s dostatečnou RCF, pro lýzu často termoblok.

Časté dotazy – Extrakce DNA & RNA

Jaký kit zvolit pro izolaci DNA z krve?

Při malém počtu vzorků kolonkový mini kit, při desítkách a stovkách vzorků kit s magnetickými kuličkami nebo ve formátu 96 jamek. Pokud potřebujete velmi dlouhé fragmenty, zvolte kit na vysokomolekulární DNA, např. NucleoBond CB.

Jaký je rozdíl mezi kolonkami a magnetickými kuličkami?

Kolonky se zpracovávají centrifugací nebo vakuem a jsou ideální pro menší počet vzorků. Magnetické kuličky nevyžadují centrifugaci a snadno se automatizují, proto jsou výhodné při vysokém počtu vzorků.

Co je core kit?

Core kit obsahuje jen vazebné kolonky nebo destičky a pufry. Spotřební materiál jako bloky, promývací destičky či zkumavky se objednává zvlášť, takže se vyplatí hlavně těm, kdo ho už mají.

Mohu kity použít pro diagnostiku?

Většina kitů je určena jen pro výzkumné účely (RUO). Pro diagnostické použití vybírejte kity označené CE-IVD – u každého produktu je to uvedeno v popisu.

Jak zabráním degradaci RNA?

Pracujte rychle, na ledu a s pomůckami bez RNáz, vzorky stabilizujte co nejdříve po odběru a izolovanou RNA skladujte při −80 °C. U krve pomáhají odběrové zkumavky se stabilizačním roztokem.

Co dělat, když vzorek obsahuje inhibitory PCR?

U půdy, stolice, rostlin či potravin zvolte kit určený pro danou matrici – obsahuje kroky k odstranění inhibitorů. Doplňkově můžete použít i samostatné kolonky k odstranění inhibitorů.